米曲霉脂肪酶（lipase from Aspergillus oryzae, AOL）和Novozym 435购自上海源叶生物科技有限公司, 2-甲基咪唑和二水合乙酸锌（分析纯）购自上海麦克林生化科技股份有限公司, 棕榈酸对硝基苯酯（p-nitrophenyl-palmitate, p-NPP）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司（上海）, 大豆油购自金龙鱼食品集团有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2.1 AOL@ZIF-8的制备

AOL@ZIF-8通过参考文献[13]的方法, 稍做调整而合成。配制40 mmol/L的乙酸锌溶液, 缓慢加入5 mL AOL酶液, 静置15 min。配制800 mmol/L的2-甲基咪唑溶液, 用乙酸将pH调至8.0, 再缓慢加入乙酸锌和酶的混合液中, 以300 r/min转速搅拌60 min。所得产物以10 000 r/min离心10 min, 用去离子水清洗3次, -48 ℃冷冻干燥, 得到固定化酶AOL@ZIF-8。

1.2.2 Zn²⁺和2-甲基咪唑对酶活力的影响

配制不同浓度的乙酸锌和2-甲基咪唑溶液, 将游离脂肪酶分别置于上述溶液中静置孵育30 min, 然后测试酶活力。

1.2.3 脂肪酶浓度测定

脂肪酶的浓度测定参考Bradford法^[23]并稍做改动。配制一系列不同浓度的标准蛋白溶液, 在酶标仪中测定其在595 nm处的吸光度, 每个样品测三次, 取其平均值。以标准蛋白质溶液浓度为横坐标, 595 nm处吸光度值为纵坐标, 绘制蛋白质浓度的标准曲线。

1.2.4 脂肪酶活力测定

采用p-NPP法进行酶活力测定。总反应体系是1 mL, 将脂肪酶与50 mmol/L磷酸缓冲液混合, 在40 ℃水浴中保温孵育5 min。取20 μ L对硝基苯基棕榈酸酯异丙醇溶液, 加入反应体系中混匀开始计时, 5 min后, 加入200 μ L过氧化氢溶液终止反应。测定显色后离心的上清待测反应液在410 nm处的吸光度。一个脂肪酶催化活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1 μ mol对硝基苯酚的量。每个样品做三组平行样品。

1.2.5 固定化酶的储存稳定性

称取一定质量的固定化脂肪酶AOL@ZIF-8 和游离AOL, 将其分别放置于冰箱冷藏室4 ℃保存, 间隔不同的时间（0~60 d）取一定质量的酶与p-NPP底物溶液反应5 min, 测定酶活力。以存放前的活力为100%, 计算不同贮藏时间后的相对活力。

1.2.6 脂肪酶催化剂制备生物柴油

称取5 g大豆油和适量甲醇（甲醇与油的摩尔比为3:1, 油的分子量以768 g/mol计算）, 置于15 mL耐压瓶中, 再加入0.1 g AOL@ZIF-8（或相同质量的游离AOL和商业固定化酶Novozym 435）。在45 ℃和转速为300 r/min下反应24 h。反应结束后, 以10 000 r/min离心5 min, 得到分层的样品, 按照体积比1:1加入去离子水, 水洗去除产物中残留的甲醇。再次离心分层取上层样品, 加入少许无水氯化钙, 震荡摇匀去除生物柴油样品中的水分。再次离心, 取上层样品即为制备得到的生物柴油。

以此工艺参数为基础, 后续改变相关参数进行单因素实验, 优化生物柴油制备工艺。

1.2.7 AOL@ZIF-8重复使用性能

取一定质量的AOL@ZIF-8用于催化大豆油与甲醇反应制备生物柴油。将离心所得AOL@ZIF-8用磷酸盐缓冲液（pH = 8.0）清洗3次, 将洗涤后的AOL@ZIF-8重新加入新鲜的反应混合物中, 进行下一轮的生物柴油制备。每轮催化反应进行24 h, FAME产率通过气相色谱进行分析。

1.2.8 催化剂结构表征方法

采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）（日本, Hitachi, S-4800）观察样品的微观结构和形貌, 加速电压设置为20 kV, 放大倍数为20~50万倍。采用快速升温热重系统对样品进行热重分析（thermo gravimetric analyzer, TGA）（美国, Waters, SDT650）, 气体氛围为10 mL/min的氮气气氛, 以10 ℃/min的速率由室温升至1 000 ℃。

1.2.9 生物柴油产物分析方法

采用气相色谱法对生物柴油中的FAME含量进行测试。称取20 mg生物柴油样品, 加入正己烷, 定容至5 mL, 然后混匀。溶液经0.25 μ m针式过滤器过滤, 通过气相色谱仪（日本, Shimadzu, GC-2010Plus）测定, 进行分析。色谱检测条件如下：进样口温度250 ℃, 进样量1.0 μ L, 分流比30:1; FID检测器温度300 ℃; 载气为氩气, 流速30 mL/min; 升温程序为初温100 ℃, 以28 ℃/min升至185 ℃, 然后以20 ℃/min 升至225 ℃, 再以5 ℃/min升至240 ℃, 保持3 min。

生物柴油产率定义为FAME与原油的质量比, 用质量百分比表示, 根据下式计算：

(1)

式中：Y为生物柴油产率, %; m为待测产品的质量, g; C_i为各脂肪酸甲酯的浓度, g/cm³; V为容量瓶的恒定体积, cm³。

酶作为一种生物蛋白催化剂, 相比于传统的化学催化剂, 对反应条件比较敏感, 易受外界因素的干扰。其中温度、pH、重金属和有机化合物等都可能对酶的催化活性产生影响^[24]。本固定化体系中含有金属离子Zn²⁺和有机配体2-甲基咪唑的混合溶液, 可能会影响酶的活性。因此, 考察了金属离子和有机配体对AOL的影响。

如图1（a）所示, 相比于直接在水中孵育的脂肪酶, 在乙酸锌溶液中孵育后, AOL酶活力先是随着Zn²⁺浓度增加而升高, 然后随着Zn²⁺浓度进一步升高而有所下降。当Zn²⁺浓度为40 mmol/L时, 酶活力提高幅度最大, 是其在水溶液中的1.6倍左右, 这是由于Zn²⁺对部分脂肪酶起到稳定和激活作用^[25], 而且Zn²⁺有助于维持蛋白质三级结构中二级元素的灵活性, 促进特定氢键相互作用和重排, 从而促进脂肪酶更稳定的活性状态。因此, 选择40 mmol/L Zn²⁺溶液为固定化过程的最佳浓度, 制备的AOL@ZIF-8酶活力回收率高达95%。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 Zn2+浓度（a）和2-甲基咪唑浓度（b）对AOL酶活力的影响Fig. 1 Effect of Zn2+ concentration (a) and 2-methylimidazole concentration (b) on the enzyme activity of AOL

2-甲基咪唑浓度对酶活力的影响则相反, 如图1（b）, 相比于水溶液, 在2-甲基咪唑溶液中孵育30 min后的AOL酶活力有一定程度的下降, 这是由于2-甲基咪唑溶液呈碱性, 碱性环境会在一定程度对脂肪酶酶活力产生不利影响。经实验测定, 400 mmol/L 2-甲基咪唑溶液的pH接近11, 而强酸^[26]或强碱^[27]溶液有很大可能会导致酶失活, 尤其是脂肪酶^[28]。因此, 制备过程采用乙酸调节体系pH至8。

利用场发射扫描电镜观察不同乙酸锌与2-甲基咪唑比例条件下AOL@ZIF-8的形貌结构。结果发现乙酸锌和2-甲基咪唑质量比为1:20的条件下制备得到的AOL@ZIF-8呈层状纳米花结构, 具有较大的比表面积^[29], 如图2（a）所示, 在催化反应时能和底物充分接触, 具有较高的催化活性。通过热重分析考察AOL@ZIF-8中酶的比例。如图2（b）所示, 在120~190 ℃之间观察到AOL@ZIF-8的第一分解阶段。在该阶段观察到大约24%的重量损失, 这对应于客体分子如H₂O和有机小分子的损失^[30]。下一个分解阶段从300 ℃开始, 在600 ℃左右结束, 占重量损失的45%, 对应酶的分解过程。此外, X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）结果表明ZIF-8和AOL@ZIF-8具有相似的光谱结构, 且与相关文献合成的有机金属框架材料ZIF-8的XRD衍射峰一致^[31]。

图2

Fig. 2

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	图2 AOL@ZIF-8的SEM图（a）和TGA曲线（b）Fig. 2 SEM image (a) and TGA curve (b) of AOL@ZIF-8

酶的储存稳定性是其商业化应用的重要指标, 游离酶和固定化酶的储存稳定性如图3所示。

图3

Fig. 3

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	图3 游离酶和固定化酶的储存稳定性Fig. 3 Storage stabilities of free and immobilized AOL

图3中, 随着储存时间的延长, 游离酶和固定化酶的活性均有一定程度下降。AOL@ZIF-8在存放10 d后酶活力才出现明显下降, 存放两个月之后, 酶活力仍能保持在60%。而游离酶活性下降比较迅速, 10 d时酶活力仅约为40%, 两个月后几乎失去全部活性。此外AOL@ZIF-8的酶活力下降曲线趋势比游离酶明显更为平稳, 可见AOL固定在金属有机框架ZIF-8载体上后, 其储存稳定性得到显著提高。

2.4.1 油醇摩尔比的影响

在大豆油的醇解过程中, 高浓度的醇可帮助反应平衡向右移动, 但过量的醇也会导致脂肪酶失活。如图4所示, 随着油醇摩尔比的增大, 生物柴油的产量先升高再降低。当油醇比为1:4时, 反应24 h后AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率最高为90.26%, 而此时游离酶AOL催化的生物柴油产率仅为73.95%。

图4

Fig. 4

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	图4 油醇摩尔比对生物柴油产率的影响Fig. 4 Effect of molar ration of oil to alcohol on biodiesel yield

2.4.2 甲醇添加方式

醇的添加方式对酶催化制备生物柴油有很大影响。如图5所示, 当甲醇分四次等量添加到反应体系时, 生物柴油产率均最高。AOL@ZIF-8、游离酶AOL和商业固定化酶Novozym 435催化得到的生物柴油产率分别为91.05%、82.39%和91.09%。

图5

Fig. 5

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	图5 甲醇添加方式对生物柴油产率的影响Fig. 5 Effect of methanol addition method on biodiesel yield

2.4.3 反应温度

如图6所示, 当温度为50 ℃时, AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率最高, 为92.74%。而游离酶AOL在温度为40 ℃时得到的生物柴油产率最高仅为84.29%, 由此可表明经固定化后AOL的温度耐受性也显著提高。同时反应时间对生产成本影响较大, 也是比较重要的影响因素。

图6

Fig. 6

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	图6 反应温度对生物柴油产率的影响Fig. 6 Effect of reaction temperature on biodiesel yield

2.4.4 反应时间

由图7可知, 随着反应时间的延长, 生物柴油产率整体都是先升高后趋于一个相对稳定的趋势。当反应时间为24 h时, AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率可达到93.03%, 此时反应逐渐趋于平衡, 继续延长反应时间会降低生产效率并增加成本。

图7

Fig. 7

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	图7 反应时间对生物柴油产率的影响Fig. 7 Effect of reaction time on biodiesel yield

2.4.5 酶添加量

酶添加量对生物柴油产率的影响如图8所示。图中可见, 随着酶添加量增加, 生物柴油产率整体都是先升高后略微下降的趋势。酶含量的增加使其与大豆油的接触更为充分, 反应速率加快。生物柴油产率随酶量的增加呈现先升高后趋于平衡, 甚至有降低的趋势。在酶添加量为大豆油质量的4%时, AOL@ZIF-8催化制备生物柴油产率最高达93.59%。而游离AOL在添加量为大豆油的5%时才达到最高生物柴油产率为86.75%, AOL@ZIF-8的酶用量少于游离AOL, 得到的生物柴油产率仍较高, 这也表明固定化提高了AOL的催化活性和经济效益。

图8

Fig. 8

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	图8 酶添加量对生物柴油产率的影响Fig. 8 Effect of enzyme dosage on biodiesel yield

2.4.6 加水量

含水量是影响生物柴油产率的一个重要参数。酶分子表面有一层“ 必须水” 对维持酶分子的最适构型有着重要作用^[28], 在酯交换过程中, 也会影响反应平衡^[32], 过多的水在体系中会发生如水解等副反应^[33]。如图9所示, 随着含水量的增加, 生物柴油产率也是整体呈现先升高后下降的趋势。在加水量为大豆油质量分数的4%时, AOL@ZIF-8催化生物柴油产率最高为94.08%。在整个优化过程中, AOL@ZIF-8催化生物柴油的表现都与商业固定化酶Novozym 435表现相似, 甚至略优于商业固定化酶。这种使用AOL@ZIF-8催化制备生物柴油的成功尝试, 显示了其在实际应用中的巨大潜力。

图9

Fig. 9

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	图9 加水量对生物柴油产率的影响Fig. 9 Effect of water dosage on biodiesel yield

将固定化酶AOL@ZIF-8用于制备生物柴油, 测试了其重复使用性能, 并与商业固定化酶Novozym 435进行比较。由图10可知, AOL@ZIF-8在重复10次后仍能获得78%左右的生物柴油产率, 与商业固定化酶Novozym 435接近。后期脂肪酶催化性能的下降, 可能是由于甲醇对酶的毒害作用以及副产物甘油逐渐吸附在载体ZIF-8表面, 阻碍酶分子与底物接触。

图10

Fig. 10

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	图10 固定化酶的重复利用Fig. 10 The reusability of immobilized lipase