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2024 , Vol. 12 >Issue 2: 209 - 215

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.2095-560X.2024.02.012

甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理*

  • 王晨 1 ,
  • 宋国杰 1 ,
  • 孙海彦 2 ,
  • 闫俊书 3 ,
  • 宦海琳 3 ,
  • 窦少华 4 ,
  • 孙付保 , 1, †
展开
  • 1.江南大学 生物工程学院,江苏 无锡 214122
  • 2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口 571101
  • 3.江苏省农业科学院畜牧研究所,南京 210014
  • 4.大连大学 生命健康学院,辽宁 大连 116622
† 通信作者：孙付保,E-mail：

作者简介：王晨（1998-）,女,硕士研究生,主要从事生物资源与生物炼制研究。孙付保（1975-）,男,博士,教授,主要从事生物质制糖工程和能源生物技术研究。

收稿日期: 2023-06-19

  要求修回日期: 2023-10-19

  网络出版日期: 2024-04-30

基金资助

国家自然科学基金面上项目（22278189）

科技部国家重点研发计划专项项目（2019YFE0114600）

财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系项目（CARS-11-HNSHY）

收起

Alkali Catalyzed Aqueous Glycerol Pretreatment of Sugarcane Bagasse

  • Chen WANG 1 ,
  • Guojie SONG 1 ,
  • Haiyan SUN 2 ,
  • Junshu YAN 3 ,
  • Hailin HUAN 3 ,
  • Shaohua DOU 4 ,
  • Fubao SUN , 1, †
Expand
  • 1. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
  • 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
  • 3. Institute of Animal Science, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
  • 4. College of Life and Health, Dalian University, Dalian 116622, Liaoning, China

Received date: 2023-06-19

  Request revised date: 2023-10-19

  Online published: 2024-04-30

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版权所有 © 《新能源进展》编辑部
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摘要

建立了一种木质纤维素的碱催化甘油水溶液预处理方法以期选择性分离组分和提高底物的可酶解性。实验确定了碱催化甘油水溶液预处理甘蔗渣的条件为：温度180β℃、NaOH添加量7%、反应时间45 min以及甘油水溶液浓度80%。在该条件下,甘蔗渣的纤维素和半纤维素保留率分别为93.0%和83.4%,而木质素脱除率接近80%,达到了理想的组分分离效果。预处理后底物（20 g/L）在CTec 2酶载量10 FPU/g干基下水解72 h酶解率为79.6%,表明预处理后底物具有较好的可酶解性。利用现代分析技术解析了甘蔗渣预处理前后的组成结构演变规律,初步探明了碱催化甘油水溶液预处理有效提升生物质原料可酶解性的原因。

关键词： 木质纤维素生物质; 甘油水溶液; 组分分离; 酶解糖化; 可发酵性糖

本文引用格式

王晨 , 宋国杰 , 孙海彦 , 闫俊书 , 宦海琳 , 窦少华 , 孙付保 . 甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理*[J]. 新能源进展, 2024 , 12(2) : 209 -215 . DOI: 10.3969/j.issn.2095-560X.2024.02.012

Abstract

This study introduced an alkali-catalyzed aqueous glycerol pretreatment for fractionation of sugarcane bagasse to improve the enzymatic hydrolysability. The pretreatment conditions were optimized at 180 °C, 7% NaOH addition, 45 min, and 80% glycerol in an aqueous solution. The pretreatment led to 93.0% and 83.4% cellulose and hemicellulose retention, respectively, while 80% of the delignification indicated a satisfactory component fractionation. Subsequently, the enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate (20 g/L) was 79.6% at the hydrolytic condition of 10 FPU/g-dry substrate (CTec 2) for 72 h, meaning that the pretreated substrate was capable of good enzymatic hydrolysability. The structural evolution of sugarcane bagasse before and after the pretreatment was analyzed by modern analytical techniques, and the reason for the good enzymatic hydrolysability of lignocellulose substrate contributed by alkali-catalyzed aqueous glycerol pretreatment was preliminarily made.

Key words： lignocellulosic biomass; aqueous glycerol solution; component fractionation; enzymatic hydrolysis and saccharification; fermentable sugar

0 引言

木质纤维素类生物质原料具有储量丰富、来源广泛和碳中性等诸多优势,被认为是最有前景的可再生生物质资源。其主要由30% ~ 60%纤维素、20% ~ 35%半纤维素和15% ~ 30%木质素组成[1],其中纤维素微纤丝是生物质细胞壁结构的基本骨架,周围由半纤维素和具有三维网格结构的木质素通过分子链内/层间氢键及共价键稳定连接,从而导致了高生物顽抗性和难以被有效生物降解[2]。因此,酶基生物质精炼加工前通常需要进行预处理以拆解原料的高生物顽抗性,进而提高纤维素酶对纤维质糖的可及性[3]。
近年来,有机溶剂预处理作为一种简单有效和安全环保的生物质组分拆解方法,受到了国内外研究学者们的广泛关注。其中,高沸点甘油有机溶剂预处理具有常压运行、运行安全、组分溶解性好、以及呋喃类发酵抑制物生成量少等优势,已成为木质纤维素富有前景的预处理技术之一[4]。本课题组前期建立了甘油有机溶剂预处理木质纤维素生物质的方法[5]。比如,碱催化常压甘油预处理（240β℃,30 min）蔗渣在保留约88%纤维素和约75%半纤维素前提下脱除了较高的木质素（> 70%）,显著提高了预处理后底物的可酶解性[6]。尽管如此,该预处理方法仍存在一些瓶颈问题：（1）预处理过程的反应温度过高;（2）使用纯甘油会增加预处理的溶剂成本;（3）黏度过高的纯甘油预处理体系将导致下游有机溶剂木质素分离以及溶剂回收利用困难。因此,如何在保证良好的组分分离和底物可酶解性前提下改进该预处理方法,成为亟待解决的问题。
研究显示,预处理溶剂添加适量水对提升预处理效果具有积极作用。WEI等[7]研究发现在离子液体预处理中添加一定量的水,可以降低预处理体系黏度,增强生物质溶解的传质效率,从而有效提高预处理效果。NOVO等[8]发现水在木质素醚键断裂过程中具有亲核行为,可一定程度地促进有机溶剂对木质素组分的解离。LING等[9]也发现在酸催化乙二醇预处理蔗渣中添加少量水（10%）可提高木质素和半纤维素去除率,同时获得更高的纤维素保留率。因此,甘油有机溶剂预处理过程中添加适量水不仅有助于降低甘油黏度和减少溶剂用量,而且可能会提升预处理效果。
基于此,本文尝试构建新型碱催化甘油水溶液预处理方法,首先考察预处理过程主要参数（反应温度、NaOH添加量、反应时间和水添加量）对蔗渣生物质组分选择性拆解的影响,确立最佳预处理反应条件;随后在不同酶载量和固体负荷下评估预处理底物的可酶解性;最后利用现代技术表征手段分析此预处理方法提升底物可酶解性的原因。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

甘蔗渣取自广西壮族自治区,使用前过20目筛,并置于60β℃烘箱干燥至恒重。其三大组分含量分别为39.1%的纤维素、22.0%的半纤维素和25.2%的木质素。工业甘油（纯度大于99.5%）购自无锡化工厂。纤维素酶CELIC®CTec2（120 FPU/g）由北京诺维信投资有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 甘蔗渣生物质预处理
预处理过程在高温高压反应釜（K-PPA,南京正信）中进行。首先将10 g甘蔗渣与100 g甘油水溶液置于反应釜内,设置搅拌转速为180 r/min。随后通过单因素优化来确定最佳预处理条件,设置反应温度为120 ~ 200β℃、NaOH质量浓度为1% ~ 9%（如无特殊说明,均指质量百分数）、反应时间为15 ~ 90 min、甘油含量为30% ~ 100%。待反应结束后,预处理生物质浆液通过G1砂芯漏斗过滤,滤饼用150 mL自来水洗涤两次。最后,将固体底物在60β℃烘箱中干燥8 h,所得样品置于干燥器中密封保存备用。
1.2.2 纤维质底物酶解糖化
酶解过程在100 mL的三角瓶中进行,加入一定量的柠檬酸盐缓冲液（0.05 mol/L,pH 4.8）,纤维质底物的固体含量为20 ~ 100 g/L,纤维素酶CTec2的酶载量为5 ~ 30 FPU/g干底物。摇床转速设置为180 r/min,反应温度为50β℃。对底物酶解过程进行定期取样（0.4 mL）检测,样品置于沸水浴中煮沸10 min使纤维素酶变性,随后测定酶解液中的葡萄糖和木糖浓度。酶解率按照公式（1）计算：
$\text { 酶解率 }=\frac{\text { 葡萄糖产量 } \times 0.9}{\text { 纤维素含量 }} \times 100 \%$(1)

1.3 分析表征方法

1.3.1 生物质组分及酶解液成分测定
采用美国国家可再生能源实验室两步酸水解法检测甘蔗渣样品的组分含量[10]。用高效液相色谱仪（Chromaster CM5110,日本日立）检测酶解液中葡萄糖和木糖浓度,该液相色谱仪配有示差检测器和Bio-Rad HPX-87H有机酸色谱柱（9 μm,300 mm × 7.8 mm）,柱温设置为60β℃,流动相为5 mmol/L硫酸,流速为0.6 mL/min。
1.3.2 固体底物结构表征
采用场发射扫描电子显微镜（SU8020,日本日立）解析预处理前后蔗渣的表面形貌特征,测试时先称取微量样品烘至恒重并进行镀金处理,随后将样品放大至500倍进行观察。利用傅里叶变换红外光谱仪（NEXUS,美国尼力高）分析预处理底物的官能团结构变化规律,光谱记录采用衰减全反射模式（attenuated total refraction, ATR）,测量范围为4 000 ~ 500 cm-1,分辨率为4 cm-1。使用X射线衍射仪（D8 ADVANCE,德国布鲁克）分析样品结晶度变化情况[11]。晶体指数（Icr）按照公式（2）计算：
${{I}_{\text{cr}}}=\frac{{{i}_{002}}-{{i}_{\text{am}}}}{{{i}_{002}}}\times 100%$ (2)
式中：i002为结晶区的衍射强度;iam为无定形区的衍射强度。

2 结果与讨论

2.1 碱催化甘油水溶液预处理甘蔗渣的条件

2.1.1 预处理温度
实验首先考察了预处理反应温度对生物质组分拆解的影响规律。如表1所示,当预处理温度为120β℃时生物质的固体回收率高达85.6%,木质素脱除率仅为38.1%。这表明,较低的反应温度不足以破坏木质素结构单元的连接键,进而导致组分溶解分离效果不佳。当反应温度升高至140β℃时,木质素脱除率显著提高至61.9%,这使得预处理后固体回收率（75.4%）明显下降。当反应温度从140β℃上升至200β℃时,木质素脱除率继续提高（72.9%）,纤维素和半纤维素的保留率分别从97.4%和95.2%降至88.8%和80.1%,这表明过高的反应温度会导致纤维素和半纤维素的不可逆降解[12]。预处理条件的选择是在纤维素和半纤维素保留率尽可能高的前提下,木质素脱除率越高表明暴露出更多的纤维素和半纤维素,从而有利于后续酶解产糖[13]。在温度达到180β℃时纤维素保留率达到90%以上,继续提升温度至200β℃,纤维素保留率会继续下降且增加能耗。基于此,在综合考虑预处理过程的能量消耗、木质素脱除率、综纤维素保留率及其在固体底物中含量后,选择180β℃作为最佳预处理温度。
Table 1 Effect of pretreatment temperature on the deconstruction of lignocellulosic biomass

表1 预处理温度对生物质组分拆解的影响

预处理温度/℃ 回收率/% 组分含量/% 组分保留率/% 木质素脱除率/%
纤维素 半纤维素 木质素 纤维素 半纤维素
120 85.60 44.17 24.27 18.22 96.80 94.39 38.09
140 75.40 50.44 27.79 12.72 97.37 95.20 61.93
160 71.70 50.57 26.69 13.10 92.83 86.95 62.71
180 69.80 51.37 26.84 11.75 91.80 85.12 67.44
200 68.90 50.35 25.60 9.90 88.82 80.14 72.92

注：NaOH浓度为5.0%,预处理时间为30 min,甘油浓度为80%。

2.1.2 加碱量
在反应温度为180β℃条件下考察不同NaOH添加量对蔗渣预处理性能的影响,结果见表2。当NaOH添加量为1%时木质素脱除率为37.2%,溶剂体系无法实现蔗渣原料的有效拆分,预处理过程仅溶解了20%的生物质组分。当NaOH添加量从3%增加至7%时,木质素脱除率大幅提高（从63.9%提高至77.9%）,纤维素的保留率基本不变（约92%）,而半纤维素的保留率会有所下降（从89.6%降至82.5%）。这是由于增大NaOH添加量会提高溶剂碱强度,不仅能够显著破坏半纤维素与木质素分子之间的酯键,也有助于木质素醚键的断裂,进而促进其溶解分离[14]。尽管继续增大NaOH添加量可获得更高的木质素脱除率,但过高的碱用量也会增加预处理成本和环保负担。结合木质素脱除率、纤维质糖保留率等考虑,实验选择7% NaOH作为预处理碱添加量。
Table 2 Effect of alkali addition on the deconstruction of lignocellulosic biomass

表2 加碱量对生物质组分拆解的影响

NaOH浓度/% 回收率/% 组分含量/% 组分保留率/% 木质素脱除率/%
纤维素 半纤维素 木质素 纤维素 半纤维素
1.0 80.00 45.88 25.01 19.77 93.97 90.90 37.22
3.0 74.30 49.32 26.53 12.23 93.82 89.56 63.92
5.0 69.80 51.37 26.84 11.75 91.80 85.12 67.44
7.0 67.70 52.96 26.82 8.23 91.79 82.49 77.88
9.0 65.50 54.30 27.73 6.60 91.06 82.52 82.84

注：预处理温度为180β℃,预处理时间为30 min,甘油浓度为80%。

2.1.3 预处理时间
实验进一步评估预处理时间对生物质组分拆解的影响。如表3所示,当预处理时间从15 min延长至90 min时木质素脱除率从76.5%略微提高至79.9%,而纤维素和半纤维素组分基本维持不变。尽管延长预处理时间可增加甘油向底物内部的渗透作用并强化反应过程[15],但当反应温度和碱用量确定后,预处理时间对生物质组分溶解的促进作用非常有限。综合来看,当预处理时间为45 min时固体底物具有较好的木质素脱除率（78.5%）,因此实验选择45 min作为合适的预处理时间。
Table 3 Effect of pretreatment time on the deconstruction of lignocellulosic biomass

表3 预处理时间对生物质组分拆解的影响

预处理时间/min 回收率/% 组分含量/% 组分保留率/% 木质素脱除率/%
纤维素 半纤维素 木质素 纤维素 半纤维素
15 68.13 52.27 26.81 8.68 91.17 82.99 76.52
30 67.70 52.96 26.82 8.23 91.79 82.49 77.88
45 67.00 54.24 27.40 8.10 93.04 83.41 78.46
60 66.00 54.14 27.59 8.16 91.48 82.73 78.62
90 65.00 55.22 27.00 7.81 91.90 79.74 79.85

注：预处理温度为180β℃,NaOH浓度为7.0%,甘油浓度为80%。

2.1.4 甘油添加量
实验最后探究了甘油浓度对生物质预处理特性的影响。如表4所示,在30%低甘油浓度下预处理过程的组分选择性相对较差,纤维素保留率和木质素脱除率分别为87.6%和73.5%,过量的水会在预处理中电离氢离子加剧纤维素和半纤维素的损失。这种损失会随着甘油浓度增大而明显减少,从而保护了综纤维素,同时甘油浓度增大也促进了木质素的脱除[16]。当甘油浓度增大至80%时,纤维素保留率和木质素脱除率分别提高至93.0%和78.5%。进一步增大甘油浓度,生物质组分含量变化并不显著且高黏度溶液传质会受到限制。因此,实验选择80%作为预处理过程的甘油浓度。
Table 4 Effect of glycerol percentage on the deconstruction of lignocellulosic biomass

表4 甘油浓度对生物质组分拆解的影响

甘油浓度/% 回收率/% 组分含量/% 组分保留率/% 木质素脱除率/%
纤维素 半纤维素 木质素 纤维素 半纤维素
30 64.60 52.99 27.13 10.35 87.64 79.63 73.46
45 65.10 53.61 27.34 9.35 89.35 80.86 75.84
60 66.00 53.42 27.38 8.70 90.26 82.10 77.21
75 66.20 53.48 27.36 8.43 90.64 82.29 77.85
80 67.00 54.24 27.40 8.10 93.04 83.41 78.46
90 67.50 54.70 27.51 7.80 94.53 84.37 79.10
100 67.70 54.92 27.59 7.62 95.19 84.86 79.52

注：预处理温度为180β℃,NaOH浓度为7.0%,预处理时间为45 min。

综上所述,碱催化甘油水溶液预处理蔗渣生物质的预处理条件确定为：反应温度180β℃、NaOH添加量7%、反应时间45 min及甘油水溶液浓度80%。在此条件下,预处理过程脱除78.5%的木质素,同时保留93.0%的纤维素和83.4%的半纤维素;预处理固体底物中含有54.2%的纤维素、27.4%的半纤维素和8.1%的木质素。
所建立的相对温和的甘油水溶液预处理方法,其组分选择性显著增强,在实现木质素优先定向脱除的同时可高效保留底物中综纤维素。

2.2 预处理底物的可酶解性

实验首先在20 g/L底物浓度下考察了不同酶载量对碱催化甘油水溶液预处理底物可酶解性的影响。如图1,当酶载量为5 FPU/g时底物72 h酶解率仅为43.1%,较低的酶用量无法实现该预处理底物的高效酶解转化。当酶载量达到10 FPU/g时底物72 h酶解率显著提高至79.6%,但继续增加酶载量（15 ~ 30 FPU/g）对底物酶解率（86.3% ~ 92.9%）的提升效果相对有限。考虑到过高的酶用量会大幅增加酶水解的经济成本,实验选择酶载量为10 FPU/g,进一步探讨不同固体浓度下碱催化甘油水溶液预处理底物的酶解情况。
Fig. 1 Enzymatic hydrolysis of the pretreated substrates under different enzyme dosages

图1 不同酶载量下预处理底物的酶解情况

如图2所示,预处理底物含量分别为20、50、70和100 g/L时酶解72 h的葡萄糖浓度分别达到10、23、30和40 g/L,表明酶水解过程中释放的可发酵性糖浓度随着固体含量的增加而增大。与之相反的是,当固体含量从20 g/L增加至100 g/L时其72 h酶解率由79.6%降低至64.7%,表明底物的酶解率与预处理固体含量呈现负相关。造成该现象的主要原因是随着固体负载量的增加,体系黏度也随之增大,造成传质困难,引起流体力学问题;此外,较高的底物含量通常也对应着高糖浓度,这可能会对纤维素酶活性产生抑制作用,进而导致酶解率降低。尽管如此,与SHI等[17]构建的氨-甘油水预处理体系相比（其蔗渣在20 g/L底物浓度和纤维素酶载量30 FPU/g下72 h获得的酶解率为44.5%）,本文碱催化甘油水溶液预处理底物表现出良好的可酶解性。
Fig. 2 Enzymatic hydrolysis of the pretreated substrates under different solid loadings: (a) sugar titer; (b) hydrolysis yield

图2 预处理底物在不同底物浓度下的酶解情况：（a）糖浓度;（b）酶解率

2.3 底物预处理前后的结构解析

2.3.1 扫描电镜分析
为了阐明碱催化甘油水溶液预处理对甘蔗渣表面形貌的影响,采用扫描电镜观察原料和预处理样品的结构变化,如图3所示。
Fig. 3 Scanning electron microscope diagram of sugarcane bagasse raw material (a) and pretreated sample (b)

图3 甘蔗渣原料（a）及预处理样品（b）扫描电镜图

原始蔗渣生物质呈现出光滑且致密的纤维结构,而经过碱催化甘油水溶液预处理后甘蔗渣结构被明显破坏,出现大量的褶皱和孔洞。在预处理过程中,甘油水溶液在高温和碱性条件下能够渗透到底物中,使大量木质素和少量半纤维素被脱除,增加生物质表面的粗糙度。此外,纤维素的暴露及疏松多孔的表面结构有助于增加酶对底物的可及性,促进组分降解与转化[7]。
2.3.2 红外光谱分析
通过红外光谱表征解析了预处理前后甘蔗渣组分的官能团结构变化特征,如图4所示,在1 744 cm-1处的吸收峰代表木质素-半纤维素复合物中糖羧酯键的特征峰。在生物质预处理后该峰明显消失,这说明碱催化甘油水溶液预处理过程会显著破坏木质素-碳水化合物的内部连接键,实现生物质组分的有效拆解。此外,在1 607 cm-1处的吸收峰代表木质素苯环振动的特征峰;1 515 cm-1处的特征峰是苯环骨架和β-糖苷键的伸缩振动峰;1 243 cm-1处的吸收峰代表β-酯键的特征峰;817 cm-1处的特征峰为愈创木基木质素C-H键的伸缩振动峰。经碱催化甘油水溶液预处理后,上述特征峰强度明显减弱或部分消失,该预处理方法对木质素结构具有显著的破坏作用,内部连接键的断裂导致木质素组分的溶解分离[15]。另外,在甘油水溶液预处理样品中观察到891 cm-1处对应的无定形纤维素特征峰的强度有所增加[18],表明预处理过程提高了底物中的纤维素含量,也与前期的组分分析结果相一致。
总之,碱催化甘油水溶液预处理可以打破木质纤维素中一些主要化学键和功能性基团,在高效保留纤维素的同时,脱除部分木质素和半纤维素。
Fig. 4 Changes in functional groups of biomass fractions before and after pretreatment

图4 预处理前后生物质组分的官能团变化

2.3.3 X射线衍射分析
对预处理前后的固体样品进行X射线衍射分析,见图5。在16.2°、22.4°和34.9°的3个特征衍射峰分别对应纤维素（101）、（002）及（040）的衍射平面[19],表明蔗渣原料和预处理固体底物均属于典型的纤维素I型晶体结构。虽然碱催化甘油水溶液预处理并没有改变纤维素的构型,但却对底物的结晶度造成了影响。预处理过程会去除大量木质素和少量半纤维素进而使纤维素组分暴露,使得甘蔗渣原料的结晶度指数从55.4%增加到预处理后的65.2%。综合来看,纤维素的暴露有助于提高纤维素酶与底物的可及性,显著促进其酶解糖化效率。
Fig. 5 X-ray diffraction analysis of different samples

图5 不同样品的X射线衍射分析

3 结论

构建了木质纤维素相对温和的碱催化甘油水溶液预处理方法,确立了预处理条件为：反应温度180β℃、加碱量7.0%、反应时间45 min以及甘油浓度80%。在预处理过程中添加少量的水提高了组分选择性,该方法可以脱除近80%木质素,同时保留90%以上纤维素和80%以上半纤维素。预处理底物的可酶解性显著提高,在20 g/L固体浓度和10 FPU/g干基的酶载量条件下72 h酶解率达到80%。该预处理方法通过选择性断裂生物质表面结构及其内部关键性化学键和官能团,从而大幅提高了底物可酶解性。

参考文献

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