0 引言
金属有机框架（metal-organic frameworks, MOFs）是一类新型多孔材料[9],由有机配体与金属节点之间的配位键结合而成[10]。MOFs材料具有晶体结构多样、孔径大小可控、孔隙率高、比表面积大等特点,受到人们的广泛关注[11,12]。其中,沸石咪唑框架（zeolitic imidazolate framework, ZIF）系列可以在常温下合成、稳定性极佳而且细胞毒性可忽略不计,可用于固定化酶[13]。最具代表性的是ZIF-8,其由金属离子Zn2+ 和有机配体2-甲基咪唑环上的N原子配位形成[14]。ZIF-8具有优异的稳定性,可实现长期运行,而且其具有多孔结构、易于改性、毒性较低、生物相容性好等优势以及在常温以水为溶剂的条件下即可合成。因此,ZIF-8已被用作固定酶的载体,并在催化应用中取得了卓越的效果[15]。
本文以ZIF-8为载体,采用共沉淀法原位包埋固定米曲霉脂肪酶（命名为AOL@ZIF-8）。探究原料浓度对脂肪酶酶活力的影响,并对固定化酶的结构进行表征。通过与游离酶及商业固定化酶对比,研究AOL@ZIF-8固定化酶催化大豆油制备生物柴油的性能,并优化生产工艺。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
米曲霉脂肪酶（lipase from Aspergillus oryzae, AOL）和Novozym 435购自上海源叶生物科技有限公司,2-甲基咪唑和二水合乙酸锌（分析纯）购自上海麦克林生化科技股份有限公司,棕榈酸对硝基苯酯（p-nitrophenyl-palmitate, p-NPP）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司（上海）,大豆油购自金龙鱼食品集团有限公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 AOL@ZIF-8的制备
AOL@ZIF-8通过参考文献[13]的方法,稍做调整而合成。配制40 mmol/L的乙酸锌溶液,缓慢加入5 mL AOL酶液,静置15 min。配制800 mmol/L的2-甲基咪唑溶液,用乙酸将pH调至8.0,再缓慢加入乙酸锌和酶的混合液中,以300 r/min转速搅拌60 min。所得产物以10 000 r/min离心10 min,用去离子水清洗3次,-48 ℃冷冻干燥,得到固定化酶AOL@ZIF-8。
1.2.2 Zn2+ 和2-甲基咪唑对酶活力的影响
配制不同浓度的乙酸锌和2-甲基咪唑溶液,将游离脂肪酶分别置于上述溶液中静置孵育30 min,然后测试酶活力。
1.2.3 脂肪酶浓度测定
脂肪酶的浓度测定参考Bradford法[23]并稍做改动。配制一系列不同浓度的标准蛋白溶液,在酶标仪中测定其在595 nm处的吸光度,每个样品测三次,取其平均值。以标准蛋白质溶液浓度为横坐标,595 nm处吸光度值为纵坐标,绘制蛋白质浓度的标准曲线。
1.2.4 脂肪酶活力测定
采用p-NPP法进行酶活力测定。总反应体系是1 mL,将脂肪酶与50 mmol/L磷酸缓冲液混合,在40 ℃水浴中保温孵育5 min。取20 μL对硝基苯基棕榈酸酯异丙醇溶液,加入反应体系中混匀开始计时,5 min后,加入200 μL过氧化氢溶液终止反应。测定显色后离心的上清待测反应液在410 nm处的吸光度。一个脂肪酶催化活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1 μmol对硝基苯酚的量。每个样品做三组平行样品。
1.2.5 固定化酶的储存稳定性
称取一定质量的固定化脂肪酶AOL@ZIF-8 和游离AOL,将其分别放置于冰箱冷藏室4 ℃保存,间隔不同的时间（0~60 d）取一定质量的酶与p-NPP底物溶液反应5 min,测定酶活力。以存放前的活力为100%,计算不同贮藏时间后的相对活力。
1.2.6 脂肪酶催化剂制备生物柴油
称取5 g大豆油和适量甲醇（甲醇与油的摩尔比为3:1,油的分子量以768 g/mol计算）,置于15 mL耐压瓶中,再加入0.1 g AOL@ZIF-8（或相同质量的游离AOL和商业固定化酶Novozym 435）。在45 ℃和转速为300 r/min下反应24 h。反应结束后,以10 000 r/min离心5 min,得到分层的样品,按照体积比1:1加入去离子水,水洗去除产物中残留的甲醇。再次离心分层取上层样品,加入少许无水氯化钙,震荡摇匀去除生物柴油样品中的水分。再次离心,取上层样品即为制备得到的生物柴油。
以此工艺参数为基础,后续改变相关参数进行单因素实验,优化生物柴油制备工艺。
1.2.7 AOL@ZIF-8重复使用性能
取一定质量的AOL@ZIF-8用于催化大豆油与甲醇反应制备生物柴油。将离心所得AOL@ZIF-8用磷酸盐缓冲液（pH = 8.0）清洗3次,将洗涤后的AOL@ZIF-8重新加入新鲜的反应混合物中,进行下一轮的生物柴油制备。每轮催化反应进行24 h,FAME产率通过气相色谱进行分析。
1.2.8 催化剂结构表征方法
采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）（日本,Hitachi,S-4800）观察样品的微观结构和形貌,加速电压设置为20 kV,放大倍数为20~50万倍。采用快速升温热重系统对样品进行热重分析（thermo gravimetric analyzer, TGA）（美国,Waters,SDT650）,气体氛围为10 mL/min的氮气气氛,以10 ℃/min的速率由室温升至1 000 ℃。
1.2.9 生物柴油产物分析方法
采用气相色谱法对生物柴油中的FAME含量进行测试。称取20 mg生物柴油样品,加入正己烷,定容至5 mL,然后混匀。溶液经0.25 μm针式过滤器过滤,通过气相色谱仪（日本,Shimadzu,GC-2010Plus）测定,进行分析。色谱检测条件如下：进样口温度250 ℃,进样量1.0 μL,分流比30:1;FID检测器温度300 ℃;载气为氩气,流速30 mL/min;升温程序为初温100 ℃,以28 ℃/min升至185 ℃,然后以20 ℃/min 升至225 ℃,再以5 ℃/min升至240 ℃,保持3 min。
生物柴油产率定义为FAME与原油的质量比,用质量百分比表示,根据下式计算：
式中：Y为生物柴油产率,%;m为待测产品的质量,g;Ci为各脂肪酸甲酯的浓度,g/cm3;V为容量瓶的恒定体积,cm3。
2 结果与讨论
2.1 Zn2+ 和2-甲基咪唑分别对酶的影响
酶作为一种生物蛋白催化剂,相比于传统的化学催化剂,对反应条件比较敏感,易受外界因素的干扰。其中温度、pH、重金属和有机化合物等都可能对酶的催化活性产生影响[24]。本固定化体系中含有金属离子Zn2+ 和有机配体2-甲基咪唑的混合溶液,可能会影响酶的活性。因此,考察了金属离子和有机配体对AOL的影响。
Fig. 1 Effect of Zn2+ concentration (a) and 2-methylimidazole concentration (b) on the enzyme activity of AOL图1 Zn2+ 浓度（a）和2-甲基咪唑浓度（b）对AOL酶活力的影响 |
2.2 AOL@ZIF-8结构表征
利用场发射扫描电镜观察不同乙酸锌与2-甲基咪唑比例条件下AOL@ZIF-8的形貌结构。结果发现乙酸锌和2-甲基咪唑质量比为1:20的条件下制备得到的AOL@ZIF-8呈层状纳米花结构,具有较大的比表面积[29],如图2（a）所示,在催化反应时能和底物充分接触,具有较高的催化活性。通过热重分析考察AOL@ZIF-8中酶的比例。如图2（b）所示,在120~190 ℃之间观察到AOL@ZIF-8的第一分解阶段。在该阶段观察到大约24%的重量损失,这对应于客体分子如H2O和有机小分子的损失[30]。下一个分解阶段从300 ℃开始,在600 ℃左右结束,占重量损失的45%,对应酶的分解过程。此外,X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）结果表明ZIF-8和AOL@ZIF-8具有相似的光谱结构,且与相关文献合成的有机金属框架材料ZIF-8的XRD衍射峰一致[31]。
Fig. 2 SEM image (a) and TGA curve (b) of AOL@ZIF-8图2 AOL@ZIF-8的SEM图（a）和TGA曲线（b） |
2.3 固定化酶的储存稳定性
酶的储存稳定性是其商业化应用的重要指标,游离酶和固定化酶的储存稳定性如图3所示。
Fig. 3 Storage stabilities of free and immobilized AOL图3 游离酶和固定化酶的储存稳定性 |
图3中,随着储存时间的延长,游离酶和固定化酶的活性均有一定程度下降。AOL@ZIF-8在存放10 d后酶活力才出现明显下降,存放两个月之后,酶活力仍能保持在60%。而游离酶活性下降比较迅速,10 d时酶活力仅约为40%,两个月后几乎失去全部活性。此外AOL@ZIF-8的酶活力下降曲线趋势比游离酶明显更为平稳,可见AOL固定在金属有机框架ZIF-8载体上后,其储存稳定性得到显著提高。
2.4 酶催化制备生物柴油的工艺
2.4.1 油醇摩尔比的影响
在大豆油的醇解过程中,高浓度的醇可帮助反应平衡向右移动,但过量的醇也会导致脂肪酶失活。如图4所示,随着油醇摩尔比的增大,生物柴油的产量先升高再降低。当油醇比为1:4时,反应24 h后AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率最高为90.26%,而此时游离酶AOL催化的生物柴油产率仅为73.95%。
Fig. 4 Effect of molar ration of oil to alcohol on biodiesel yield图4 油醇摩尔比对生物柴油产率的影响 |
2.4.2 甲醇添加方式
醇的添加方式对酶催化制备生物柴油有很大影响。如图5所示,当甲醇分四次等量添加到反应体系时,生物柴油产率均最高。AOL@ZIF-8、游离酶AOL和商业固定化酶Novozym 435催化得到的生物柴油产率分别为91.05%、82.39%和91.09%。
Fig. 5 Effect of methanol addition method on biodiesel yield图5 甲醇添加方式对生物柴油产率的影响 |
2.4.3 反应温度
如图6所示,当温度为50 ℃时,AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率最高,为92.74%。而游离酶AOL在温度为40 ℃时得到的生物柴油产率最高仅为84.29%,由此可表明经固定化后AOL的温度耐受性也显著提高。同时反应时间对生产成本影响较大,也是比较重要的影响因素。
Fig. 6 Effect of reaction temperature on biodiesel yield图6 反应温度对生物柴油产率的影响 |
2.4.4 反应时间
由图7可知,随着反应时间的延长,生物柴油产率整体都是先升高后趋于一个相对稳定的趋势。当反应时间为24 h时,AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率可达到93.03%,此时反应逐渐趋于平衡,继续延长反应时间会降低生产效率并增加成本。
Fig. 7 Effect of reaction time on biodiesel yield图7 反应时间对生物柴油产率的影响 |
2.4.5 酶添加量
酶添加量对生物柴油产率的影响如图8所示。图中可见,随着酶添加量增加,生物柴油产率整体都是先升高后略微下降的趋势。酶含量的增加使其与大豆油的接触更为充分,反应速率加快。生物柴油产率随酶量的增加呈现先升高后趋于平衡,甚至有降低的趋势。在酶添加量为大豆油质量的4%时,AOL@ZIF-8催化制备生物柴油产率最高达93.59%。而游离AOL在添加量为大豆油的5%时才达到最高生物柴油产率为86.75%,AOL@ZIF-8的酶用量少于游离AOL,得到的生物柴油产率仍较高,这也表明固定化提高了AOL的催化活性和经济效益。
Fig. 8 Effect of enzyme dosage on biodiesel yield图8 酶添加量对生物柴油产率的影响 |
2.4.6 加水量
Fig. 9 Effect of water dosage on biodiesel yield图9 加水量对生物柴油产率的影响 |
2.5 AOL@ZIF-8制备生物柴油的重复使用性能
将固定化酶AOL@ZIF-8用于制备生物柴油,测试了其重复使用性能,并与商业固定化酶Novozym 435进行比较。由图10可知,AOL@ZIF-8在重复10次后仍能获得78%左右的生物柴油产率,与商业固定化酶Novozym 435接近。后期脂肪酶催化性能的下降,可能是由于甲醇对酶的毒害作用以及副产物甘油逐渐吸附在载体ZIF-8表面,阻碍酶分子与底物接触。
Fig. 10 The reusability of immobilized lipase图10 固定化酶的重复利用 |
3 结论
采用共沉淀法将米曲霉脂肪酶原位包埋固定在金属有机框架材料ZIF-8上,由于Zn2+ 对酶具有激活作用,固定化酶AOL@ZIF-8酶活力回收率高达95%。AOL@ZIF-8呈层状纳米花结构,具有较大的比表面积和较高储存稳定性。以AOL@ZIF-8为催化剂、大豆油为原料,制备生物柴油。当油醇摩尔比为1:4、甲醇分四次等量加入反应体系、反应温度为50 ℃、反应时间为24 h、加酶量和加水量都为大豆油质量的4%时,利用AOL@ZIF-8催化的生物柴油产率可达到94.08%,重复利用催化制备生物柴油10次时,产率仍能达到75%左右。AOL@ZIF-8固定化酶的活性及重复使用性与商业固定化酶Novozym 435相当,具有较好的应用潜力。
