0 引言
目前,常见的秸秆预处理手段包括物理法、化学法、物理化学法及生物法等[4,5,6]。其中,化学处理法操作便捷、经济,在实际应用中受到了广泛的关注。化学处理法是指使用包括酸、碱及氧化剂在内的化学试剂对秸秆进行预处理,其中碱处理在化学处理方式中效果较优,常见的秸秆碱性处理方式包括使用含氢氧化钠、氧化钙等碱性试剂的溶液浸泡秸秆[7,8,9],利用碱性物质的皂化作用,破坏纤维素、半纤维素和木质素之间的结构,降低木质纤维素原料的聚合度与结晶度,使木质纤维素原料发生溶胀作用[10,11],增加秸秆的酶解及发酵效果[8,12]。此外,利用氧化剂的氧化分解作用,氧化降解生物质中的木质素,降低秸秆的结晶度,也能提高秸秆的水解糖化及发酵效果[13,14,15,16]。
目前,关于氧化剂及碱处理秸秆的机理研究较为充沛,但两者耦合使用时的机理研究较为薄弱。本文使用H2O2和NaOH质量比为5:8的碱性双氧水对玉米秸秆进行预处理,考察预处理剂对秸秆酶解糖化效果的影响,并优化其预处理参数。随后,对经H2O2、NaOH及碱性双氧水预处理后的秸秆固体及预处理浸出液进行分析,探讨双氧水及氢氧化钠分别在秸秆预处理中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
实验采用的玉米秸秆取自北京昌平区,选取干净完整的玉米叶片,将其剪短为1 ~ 3 cm的片段,使用粉碎机将其粉碎并过60目筛后待用。水解酶为绿色纤维素木酶（上海金穗生物）,使用whatman滤纸测定纤维素酶活（FPA = 159 FPU/g）[26]。实验中所用双氧水（30%）、氢氧化钠（A.R.）购自北京化工厂,二硝基水杨酸（A.R.）购自成都市科龙化工试剂厂。
1.2 实验方法
1.2.1 预处理方法
秸秆预处理在烧杯中进行,固液比（m/v%）为5%,使用的预处理剂为H2O2与NaOH的混合溶液（H2O2:NaOH = 5:8,质量比）。将秸秆置于烧杯中,加入一定量碱性双氧水搅拌均匀后迅速用封口膜封口,随后将烧杯置于恒温油浴中控温预处理一定时间,反应结束后,用去离子水清洗秸秆至中性,抽滤分离秸秆,于60℃烘箱中干燥至恒重待用。
1.2.2 秸秆水解方法
秸秆水解实验在装有100 mL柠檬酸缓冲液（50 mmol/L,pH = 4.8）的碘量瓶中进行,秸秆用量为1.00 g,纤维素酶使用量为48 FPU。将碘量瓶置于恒温气浴摇床（荣华仪器制造有限公司,SHZ-82气浴恒温振荡器）中进行水解反应,摇床转速为180 r/min,水解温度为40℃,水解一定时间后取样,经离心分离后取上层清液用DNS法测量溶液中的还原糖浓度[27]。
1.2.3 预处理秸秆表征方法
为考察实验所用碱性双氧水预处理玉米秸秆的机理,采用范式法测定秸秆中的木质纤维素含量[28]（上海洪纪仪器设备有限公司,FIWE3/6型）,使用扫描电子显微镜（SEM）观测预处理前后秸秆的表面形貌（Hitachi,SU 1510）。
1.2.4 预处理浸出液分析方法
用气相色谱-质谱（GC-MS）测定秸秆预处理浸出液成分（岛津,GCMS-QP 2010 SE）。参考文献[29]的方法,取离心后的秸秆预处理浸出液2 mL,加入盐酸调节溶液pH < 2,用4 mL乙醚萃取,随后用微量注射器取1 μL乙醚相注入气相色谱-质谱测定。
气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS,柱径0.25 mm,膜厚0.25 μm,长30 m;升温程序：初温55℃保持0.5 min,以15℃/min升温到100℃,保持1 min,以20℃/min升温到200℃,保持1 min,以15℃/min升温到280℃,保持1 min;扫描方式：全扫描（Scan）,扫描范围（m/z）35 ~ 500。
2 结果与分析
2.1 预处理剂使用量对秸秆酶解糖化的影响
实验首先考察不同碱性双氧水使用量对玉米秸秆水解糖化的影响,预处理温度为40℃,预处理时间为24 h。如图1所示,随碱性双氧水加入量的增加,玉米秸秆水解液还原糖浓度在0 ~ 12 h内提升,并在24 h时达到稳定,随后呈现略微下降的趋势,这可能是还原糖被进一步水解的缘故[15]。因此,随后的实验均采用24 h水解还原糖浓度评价预处理效果。如图1所示,随预处理剂加入量的提高,秸秆24 h水解还原糖浓度逐渐增加,当H2O2与NaOH加入量达秸秆质量的16%与25.6%时（H2O2:NaOH = 5:8,质量比）,还原糖浓度基本维持不变,因此最优预处理剂加入量选为秸秆质量16% H2O2 + 25.6% NaOH。
Fig. 1 The concentration of reducing sugar as a function of time under different pretreating dose图1 不同预处理剂加入量对玉米秸秆酶解效果与反应时间的关系 |
2.2 预处理时间对玉米秸秆水解糖化的影响
选用上述得到的最优预处理剂使用量,在预处理温度为40℃条件下,考察预处理时间对玉米秸秆水解糖化效果的影响。如图2所示,随预处理时间从3 h延长到24 h,酶解还原糖量由7.84 g/L逐步提高到8.69 g/L。当预处理时间达到48 h时,秸秆的水解还原糖量基本恒定（8.78 g/L）。考虑到预处理时间从3 h延长到24 h不会显著增加预处理成本,因此随后均采用24 h为预处理时间进行实验。
Fig. 2 Effect of pretreating time on the enzymolysis of corn straw at 24 h图2 不同预处理时间对玉米秸秆24 h酶解的影响 |
2.3 预处理温度对玉米秸秆水解糖化的影响
选用秸秆质量16% H2O2 + 25.6% NaOH的预处理剂量,预处理24 h,考察预处理温度对预处理后秸秆酶解糖化的影响。可以发现,在预处理温度为20 ~ 40℃范围内,随预处理温度的升高,秸秆的水解糖化效果有一定的提高,24 h酶解还原糖量由7.03 g/L逐步提高到8.67 g/L。但是,当预处理温度超过40℃时,预处理温度的提高反而引起还原糖浓度的下降（50℃下酶解还原糖量为8.53 g/L,60℃下为8.59 g/L）,这是由于过高的预处理温度增加了过氧化氢的热不稳定性,导致其木质纤维素脱除效果降低的缘故[30]。因此,后续试验均在预处理温度40℃下进行。
Fig. 3 Effect of pretreating temperature on the enzymolysis of corn straw at 24 h图3 不同预处理温度对玉米秸秆24 h酶解效果的影响 |
2.4 强碱性双氧水预处理玉米秸秆机理研究
为考察碱性双氧水与秸秆作用的过程,分别对比未处理（Blank）、去离子水（H2O）、H2O2（16%）、NaOH（25.6%）及碱性双氧水（16% H2O2 + 25.6% NaOH）处理后的秸秆酶解糖化效果（预处理剂量皆以秸秆质量的百分比计）。预处理温度为40℃,时间为24 h。如图4可知,秸秆水解糖化效果优劣顺序为Blank ≈ H2O ≈ H2O2 < NaOH < 碱性双氧水,其24 h水解还原糖量分别为1.35 g/L、1.35 g/L、1.59 g/L、7.48 g/L、8.26 g/L,H2O2单独使用时的秸秆预处理效果与H2O相似,皆不能有效提高秸秆酶解效果。
Fig. 4 Effect of different pretreating agents on the enzymolysis of corn straw at 24 h图4 不同预处理剂对玉米秸秆24 h酶解效果的影响 |
对经以上4种预处理后的秸秆成分进行分析（图5）可以发现,经H2O与H2O2处理后,秸秆中的木质纤维素及杂质含量相似,与空白试验相比,主要表现为杂质成分的降低,说明H2O2单独使用无法对秸秆木质纤维素成分产生明显影响。而NaOH处理明显提高了纤维素含量,降低了半纤维素与木质素含量,H2O2的加入则进一步强化了该效果。
Fig. 5 Lignocellulose content of straw pretreated by different pretreatment agents图 5 不同预处理剂预处理后秸秆木质纤维素含量 |
SEM分析预处理前后秸秆表面形貌（图6）,发现未经处理（Blank,图6a）与经过水浸泡（H2O,图6b）的秸秆表面结构较为平整,未被明显破坏。经过双氧水处理后（H2O2,图6c）,秸秆表面产生一定破碎,这是双氧水的氧化作用破坏了纤维素、半纤维素和木质素之间的连接键,使得秸秆中质地较疏松的部分被破坏,产生较大空隙,比表面积增大。经过NaOH处理后（图6d）,秸秆中半纤维素及木质素成分被大量溶出（图5）,秸秆表面变粗糙并出现少量的破损,这同样增大了秸秆的表面积,且有利于纤维素水解酶与秸秆内部发生作用。经碱性双氧水处理后的秸秆表面（H2O2+NaOH,图6e）同样表现为严重破损,这应该是NaOH与H2O2联合作用的效果。
Fig. 6 Images of scanning electron microscope (SEM) of straw surface pretreated by different pretreatment agents: (a) untreated straw (Blank), (b) H2O, (c) H2O2, (d) NaOH, (e) alkaline hydrogen peroxide; (f) leaching liquor picture of straw pretreated by different pretreating agents图6 不同预处理剂处理后秸秆表面SEM图像：（a）未处理（Blank）,（b）经H2O处理,（c）经H2O2处理,（d）经NaOH处理,（e）经碱性双氧水处理;（f）不同预处理秸秆浸出液 |
使用乙醚萃取秸秆浸出液并进行GC-MS分析。如图7所示,经H2O、H2O2及NaOH预处理后的秸秆浸出液GC-MS总离子流图（TIC）中未发现明显出峰（图7 a ~ 图7c）,而经碱性双氧水处理后的秸秆浸出液提取物TIC图中可以检测到若干明显响应（图7d）。这可能是由于NaOH虽然可以溶解秸秆中的木质素及半纤维素,却未能破坏其大分子结构,因此不能被乙醚溶解,而H2O2可以与被NaOH溶解的大分子有机物发生氧化还原反应,其产物能够被乙醚溶解并在GC-MS中能被检测到。对峰强度（H）大于50 000的组分进行检索,表1列举了相似度 > 80的物质。可以发现,检索结果主要为携带双键及羟基的各类环状及直链有机化合物,这应该是木质纤维素被氧化分解的结果。
Fig. 7 GC-MS image of straw leach liquor: (a) H2O; (b) H2O2; (c) NaOH; (d) H2O2 + NaOH图7 秸秆浸出液GC-MS分析：（a）H2O处理;（b）H2O2处理;（c）NaOH处理;（d）H2O2+NaOH处理 |
Table 1 GC-MS analysis of straw leach liquor pretreated by alkaline hydrogen peroxide表1 碱性双氧水预处理秸秆浸出液GC-MS成分分析 |
| Number | Molecular formula | Cas number | Strutural formula | Similarity |
|---|---|---|---|---|
| 1 | C6H10O2 | 1072-21-5 | | 86 |
| 2 | C10H18O | 32730-40-8 | | 82 |
| 3 | C8H14O3 | 22241-34-5 | | 81 |
| 4 | C10H18O | 1728-46-7 | | 81 |
| 5 | C11H20O | 32362-97-3 | | 81 |
| 6 | C6H12O2 | 931-17-9 | | 83 |
| 7 | C10H18O | 31053-82-4 | | 81 |
| 8 | C6H10O2 | 1192-78-5 | | 81 |
| 9 | C7H14O | 7443-70-1 | | 80 |
| 10 | C6H10O2 | 533-60-8 | | 80 |
| 11 | C8H16O2 | 56805-30-2 | | 80 |
| 12 | C7H14O | 41065-97-8 | | 80 |
| 13 | C10H16N2O3 | 66398-55-8 | | 80 |
3 结论
碱性双氧水预处理秸秆可以显著提高秸秆的酶解糖化效果,试验发现NaOH在预处理过程中起溶解秸秆中木质素及半纤维素的作用,对秸秆预处理效果的优劣起决定作用。H2O2的加入虽然不能对秸秆中的木质纤维素成分产生明显影响,却可以破坏秸秆表面结构,辅助提高NaOH的秸秆预处理效果。此外,当H2O2与NaOH共同使用时,H2O2可作用于被NaOH溶解的大分子物质,将其分解为多种小分子有机物,这为秸秆资源化利用提供了新途径。