0 引言
木质纤维素类生物质是地球上储量最丰富的可再生资源,主要包括农作物秸秆、林业废弃物、畜禽排泄物等,其纤维素含量可观,将其转化为能源可缓解化石燃料短缺的危机,同时可减少环境污染问题[1,2]。将木质纤维素类生物质转化为纤维乙醇,称为第二代燃料乙醇。与第一代以粮食为原料的燃料乙醇相比,纤维乙醇不仅解决了“人粮危机”,而且使废弃资源变废为宝得到资源循环利用[3]。纤维乙醇的生产一般需要经过原料预处理、酶水解和发酵过程的转化。酶水解是纤维乙醇生产过程中的关键步骤,其需要微生物蛋白酶的参与,反应过程十分复杂。再者,参与反应的生物质具有多样性并且结构复杂,使得酶与底物的接触过程存在一定的困难,加上产物的反馈抑制效应等,这些问题均增加了酶促反应的难度。研究分析酶水解过程的反应动力学有助于酶促反应过程开发和生物反应器的优化设计等。分形理论作为酶促反应研究的有效方法之一,其从抽象的研究对象及复杂非线性系统入手,可真实反映物质的内在联系。分形理论最基本的特点是采用分维的数学方法研究客观事物,不仅可以精确描述复杂系统的真实属性与状态,而且更加符合客观事物的多样性和复杂性。因酶分子表面的分形特性,可采用分形语言对酶催化动力学进行描述,“酶分形动力学”的概念也因此产生[4,5]。分形表面上酶反应的速率与表面积或颗粒半径等均有关。“酶分形动力学”模型以分形维数和反应速率常数两个衡量指标,可揭示加酶量、反应时间和底物浓度等条件对反应过程的影响,有力简化了纤维素酶促反应机理研究。反应速率主要衡量酶催化反应的快慢,分形维数主要衡量酶与底物之间的作用关系,如用分形维数衡量底物颗粒的不规则性,底物越不规则,其与酶之间的有效吸附能力越差。本文首先概述分形理论,其次阐述纤维乙醇转化理论基础,最后总结国内外分形动力学目前用于木质纤维素类生物质酶水解过程的主要动力学模型,并展望了其应用前景。
1 分形理论的概述
经典欧式几何学确定了小尺度上点、线、面之间的关系,并提出确定物质中任意位置所需的独立坐标为欧式维数。欧氏维数通常为整数,如点的维数是0,直线的维数是1[12],其缺点在于对不规则几何物体的特性不能进行描述,因此需要引入分形。分形是一种粗糙或破碎的几何图形,其组成部分可被无限细分,且其细分部分的形状一般与图形整体形貌相似。分形以某种方式在局部和整体方面呈现自相似性、标尺不变性、可迭代性和无限不规则等特点,其中由于图形具有自相似性,产生了分形维数（fractal dimension）[12,13]。在分形理论研究中,分形维数描述不同分形体系特征的定量参数,是对分形体系具有的复杂结构及其细微变化进行量化描述和表征的重要工具。分形维数与经典欧氏几何学中的整数维不同之处在于分形维数一般是小数,能更精确地描述自然形体。分形理论中,物质越复杂,则分形维数越大,其非整数部分也被称为分形维数。分形维数反映了酶水解反应速率的时间迟滞性,且变化范围在0 ~ 1之间。均相反应中认为物质是在三维空间中的分子扩散运动,而非均相的木质纤维素酶水解过程中,易水解底物不断被消耗,难水解底物占比越来越多,物质的扩散速率不断减小,反应速率也会随着反应的进行不断降低,这导致了反应速率具有时间迟滞性。
蛋白质、酶等生物有机体结构复杂、分子量大,且表面粗糙、结构不均匀,是典型的分形研究体系,适合使用分形维数对其进行特征描述。当前,分形理论仍处于研究阶段,其应用还存在一些不足。分形理论在酶分子应用方面主要是基于酶分子及其表面具有的分形特性与分形动力学具有局部相似性,因此,酶的催化动力学可用分形语言进行描述。酶水解动力学与分形理论结合即为“酶分形动力学”。酶催化反应动力学的研究最早始于经典的米氏方程（Michaelis-Menten equation）及其准稳态假设,但是研究表明,在限定维数或非均相条件下发生酶催化反应时,底物和酶的扩散一般难以达到准稳态假设的要求,此时米氏方程对酶催化动力学的表征就会出现较大的偏差。因此,酶促反应的探索长期以来主要集中在基于米氏方程,利用分形理论修正传统的米氏方程以准确模拟酶催化反应过程的研究方面。纤维素类生物质的酶水解是生产燃料乙醇的关键过程,通过建立反应动力学方程研究酶催化反应历程,对燃料乙醇生产工艺优化和反应器的设计具有重要的指导意义,将分形理论应用于木质纤维素酶水解过程可为酶水解的复杂动力学研究过程提供理论依据。
2 纤维乙醇转化理论基础
2.1 纤维乙醇生产工艺
纤维乙醇主要是指以生物质为原料通过糖化发酵等过程转化而产生的一种液体燃料,可以直接作为动力燃料或者作为燃油改善剂[16]。木质纤维素类生物质储量丰富,是生产乙醇最有前景的可再生资源。纤维乙醇的生产主要包括五个过程[17]：原料的预处理,纤维素预水解,水解液的解毒,糖化发酵以及乙醇蒸馏提纯（如图2所示）。纤维乙醇提纯后添加一定的变性剂即为燃料乙醇。燃料乙醇是一种非常重要的生物质液体燃料,可以直接作为动力燃料或者是掺入汽油中作为燃油改善剂和部分汽油的替代品。用汽油发动机的汽车,汽油中乙醇加入量在5% ~ 22%;而对于乙醇专用发动机的汽车,乙醇加入量一般在85% ~ 100%[18]。因此,发展燃料乙醇技术,不仅可以缓解能源危机,乙醇燃烧过程污染物排放量少,同时减少了有害气体的排放,且排放的CO2可被生物质吸收,实现了碳平衡,有效地改善了生态环境。
2.2 酶水解机理
木质纤维素类生物质主要化学成分包括纤维素、半纤维素和木质素,三者通过化学键链接,形成纤维原料致密、复杂的化学结构。纤维原料经过预处理后,底物中多糖组分可通过酸水解或者酶水解降解为可发酵单糖。
与酸水解方式相比,纤维底物酶法水解因条件温和、专一性强、易于控制且副产物少而被广泛应用于燃料乙醇的生产过程。纤维素酶是一种多酶复合物,主要由三种酶组成：1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖水解酶、β-D-葡糖苷酶,分别称为外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和纤维二糖酶,酶水解过程是多种酶协同作用共同降解底物的过程。
木质纤维素的酶水解是非均质多相反应[19]其主要过程如图3所示[20]。首先纤维素酶通过结合域吸附到底物上,再作用到底物表面的易水解键,纤维素酶与底物之间形成酶-底物络合物;其次β-糖苷键水解同时纤维素酶沿着纤维素链向前移动,最后纤维素酶从底物上脱附,β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。目前,纤维素酶降解底物的过程普遍认为是通过协同理论完成的[21,22]。协同作用的观点认为,结晶纤维素降解主要通过外切葡聚糖酶从链端断开β-1,4糖苷键进行。内切葡聚糖酶仅从内部断开β-1,4糖苷键,出现分裂状开放式活性中心。外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶生成的产物是纤维二糖或葡萄糖,其对酶的活性存在抑制作用。因此纤维素的有效水解须在β-葡糖苷酶的作用下打开最终的糖苷键使纤维二糖降解为单糖葡萄糖[22]。纤维底物的降解是多种酶协同作用的结果,商业纤维素酶的成本过高是当前制约燃料乙醇产业化发展的主要瓶颈[23,24]。
2.3 酶水解的影响因素
木质纤维素酶水解效果的提高对后续发酵过程至关重要。目前,提高木质纤维素酶水解效果主要有以下几种措施：（1）对原料进行有效预处理以打破底物致密的化学结构,去除木质素,提高纤维素酶与纤维底物的接触面积,以利于酶水解过程;（2）高效纤维素酶的生产;（3）酶解过程添加表面活性剂[27]等酶促反应助剂;（4）利用纤维素酶固定化技术来提高酶的作用效果;（5）酶解抑制作用的改善等。
3 纤维素酶水解反应分形动力学模型
3.1 纤维素酶水解动力学
根据底物酶水解反应的主要过程,纤维素酶水解动力学模型一般可概括为以下五类：经验模型、米氏模型、吸附模型、可溶底物水解模型和分形动力学模型,如表1所示。经验模型采用数理统计拟合方法,确定底物理化性质与水解时间之间的定量关系,在一定程度上阐明了水解性质,该机理模型通用性强,可较全面揭示水解机理,得到优化参数。但存在实验量大、耗时较长等缺点。
Table 1 Characteristics and applications of several kinetic models表1 几种动力学模型特点及应用 |
| 类型 | 条件 | 应用 | 文献 |
|---|---|---|---|
| 经验模型 | 适用于已建立模型范围内的实验条件 | 了解水解与底物性质之间的相互作用;估算初始水解速率;优化反应条件 | [29] |
| 米氏模型 | 均相反应 | 建立β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖为葡萄糖动力学模型及微晶纤维素的分解 | [30] |
| 吸附模型 | 基于Langmuir吸附等温线或动力学方程 | 纤维素吸附水解动力学模型的建立 | [31] |
| 可溶底物水解模型 | 可溶的低聚糖 | 纤维低聚糖水解动力学模型的建立;纤维素酶分解行为的揭示;纤维素酶组分协同作用的检测 | [32] |
| 分形动力学模型 | 发生在空间上受限制的反应体系中,两 种物质在非理想的底物表面的扩散 | 建立纤维素水解动力学模型 | [33] |
米氏模型是基于质量作用定律而得出[34],适用于均质反应条件,但可作为β-葡萄糖苷酶将纤维二糖转化为葡萄糖的动力学研究模型[35]。米氏模型在纤维素吸附水解过程中采用Langmuir吸附等温线动力学方程,但在涉及非理想底物的催化反应中,必须考虑底物浓度不均和分形动力学等因素。此类模型往往不能直接应用到不溶性底物的水解,主要是由于酶在不溶性底物上作用的非均相特性和底物可及性末端的分布与浓度造成的。但可溶性水解模型可深入分析纤维素水解生成的寡糖能否被内、外切葡聚糖酶降解水解机制。TING等[36]建立一个随机性模型,深入研究了纤维素酶的模块化特性。催化域（catalytic domain, CD）和纤维素结合域（cellulose binding domain, CBD）被模拟成随机移动者,其动力学被偶联到底物表面纤维素链接的压缩/扩展和纤维素链的迁移。
3.2 分形动力学模型的建立
SAVAGEAU[40]首次使用幂函数公式研究了分形介质中的米氏动力学模型,其经典的酶催化反应如式（1）,由两个明显的限速方程式（2）和式（3）表示。该法认为酶催化反应机制中,生成产物的速率要慢于底物与酶复合物的可逆反应的速率。因此,产物生成的速率决定整个酶催化反应的速率。
$S+E_{\overleftarrow k_{2}}^{\frac{k_{1}}{\rightleftarrows}}[E S] \stackrel{k_{3}}{\longrightarrow} E+P$ (1)
式中：E为酶;S为底物;ES为酶-底物复合体;P是产物;k1和k2分别为吸附和脱附速率常数;k3为产物形成的速率常数。
$\frac{\mathrm{d}[E S]}{\mathrm{d} t}=\alpha_{1} E^{g_{1}} S^{g_{2}}-\left(\beta_{1}+\alpha_{2}\right)[E S]$ (2)
$\frac{\mathrm{d} P}{\mathrm{~d} t}=v_{\mathrm{p}}=\alpha_{2}[E S]$ (3)
式中：vp为产物形成的速率;α1、α2和β1是幂函数公式新引入的参数;g1和g2分别为与底物和酶有关的速率级数。
VALJAMÄE等[41]首次采用分形动力学对木质纤维素酶水解的过程进行拟合,利用以下经验模型,描述了酶水解过程中纤维二糖随时间的变化规律：
$P=S_{0}\left[1-\exp \left(-k t^{1-h}\right)\right]$ (4)
式中：P、S0分别为生成的纤维二糖浓度和底物总糖浓度;t为时间;k、h分别为反应速率常数和底物
分形维数。
$\left\{\begin{aligned}X &=\frac{C_{0}-C}{C_{0}} \times 100=\left\{1-\exp \left[-k\left(1+\frac{t^{1-h}-1}{1-h}\right)\right]\right\} \times 100 \\&(h \geq 1) \\X &=100 \times\{1-\exp [-k(1+\ln t)]\} \\&(0 \leq h<1)\end{aligned}\right.$ (5)
式中：X为葡萄糖转化率;C、C0分别代表反应剩余糖浓度和底物中的总糖浓度。
张宇等[44]利用类分形动力学对NaOH、HCl和高温液态水三种不同的预处理方法进行比较,假定纤维素复合酶对不溶性纤维素底物为单一酶作用,受到限制的底物-纤维素酶异相反应,发生在纤维素酶表面上,并且随着反应的进行,底物越来越难水解。因此,假设反应速率与时间呈幂函数关系,同时将纤维素酶水解看作拟态的一级反应,得到还原性糖与时间的表达式：
$P_{\mathrm{S}}=\frac{S_{0}}{0.9}\left[1-\exp \left(-\frac{0.9 k}{1-h} t^{1-h}\right)\right]$ (6)
式中：PS、S0分别为生成葡萄糖浓度和底物总糖浓度。
上述已建立的木质纤维素酶水解分形动力学模型,首先,前期研究主要对经典的米氏方程进行了修正,将幂函数公式用于分形介质中得到上述酶水解分形动力学模型,即米氏动力学模型。相比于其他分形动力学模型,其方程相对复杂,且存在参数较多不易确定和难以计算等缺点,但其丰富了酶催化反应的研究途径。其次,利用分形理论建立的分形动力学都是在KOPELMAN描述的分形动力学方法的基础上推导出来的,与经典的米氏动力学酶催化反应模型相比,分形动力学模型能够用于多种条件下的复杂动力学研究,且模型更加简洁、参数少且易确定等,可进一步为木质纤维素酶水解过程中酶-底物之间的相互作用提供理论依据。最后,上述的动力学模型虽然方法不同,其结果也各异,但都是利用分形理论对酶促反应过程进行了更准确的描述和表征,为非线性理论用于木质纤维素酶水解过程的研究开辟了新的研究途径。
3.3 分形动力学模型的应用
纤维素-纤维素酶之间的反应一般受到三维限制且发生在分形表面上,使得反应速率常数不断减小,故研究者假定速率常数与时间的数学关系从而提出以速率常数k和分形维数h为参数的分形动力学模型,用于描述各种复杂条件下的木质纤维素类酶水解过程,通过非线性回归拟合可得出二者之间的关系式。大量实验表明,速率常数k与底物特性、酶用量及其活性有关。分形维数主要表征酶水解反应速率的时间迟滞现象,为反应的内在特征参数,其变化范围一般在0 ~ 1之间[13,43],并且随底物添加量和酶用量变化而变化[45];预处理和酶解条件也会对分形动力学参数产生影响,如预处理温度[46]、反应介质中添加非离子表面活性剂或聚合物[46]以及各种抑制剂;分形维数还与搅拌器的搅拌速度有关[47]。由以上分析可见,速率常数k和分形维数h能够反映底物特性、反应条件以及酶的可及性等对木质纤维素酶解糖化的高效转化的影响,故分形动力学是描述各种复杂条件下的酶水解过程的有力工具。
ZHANG等[48]在研究NaOH、HCl和高温液态水三种预处理方法对甘蔗渣酶水解效果的影响过程中,采用分形的方法对酶解过程进行非线性回归拟合,结果发现添加吐温80/木聚糖酶后,反应速率k、酶解率和糖回收率明显升高,且反应过程主要取决于速率常数而不是分形维数。
WOJTUSIK等[47]在蒸汽爆破条件下对玉米秸秆预处理,研究了玉米秸秆的酶水解反应动力学。实验拟合了两种动力学模型：经验模型和分形模型。在前一种情况下,随着搅拌速度的增加,整体序列指数n从13显著降低到2,这表明酶对纤维表面的可及性增加。分形动力学模型与实验结果拟合性更好,在低搅拌速度条件下具有更小的偏差。随着搅拌速度的增加,分形反应速率常数k增加;在250 r/min及以上达到稳定值。分形维数h随着搅拌速度的增加而减小,直至约为0.19,表明酶对底物的可及性更高。
WANG等[42]用分形动力学分析了纤维素酶负载量、底物性质、反应介质中添加非离子表面活性剂/聚合物对木质纤维素酶水解过程的影响,结果发现反应速率k随着纤维素酶用量的增加而增大;添加非离子表面活性剂/聚合物增加了反应速率k,同时可以降低分形维数h,证明了纤维素酶水解反应的复杂动力学可以用分形动力学模型进行描述。
AGUIAR等[49]在水蒸气处理甘蔗渣的研究中利用分形动力学模型,对比了预处理方法和不同洗涤工艺对底物可及性的影响。结果发现,与其他预处理方法的反应速率k值相比,磷酸预处理和水洗条件下产生的底物最易被水解,能够促进反应速率k的增大。较低的分形维数h表征了更易水解的底物其具有较高的非晶特性。而碱洗过程自水解产生的底物与酶最不易接触。较高的分形维数h值通常与蒸汽处理底物中的高木质素含量有关,因为木质素的存在导致酶的无效吸附,从而降低了部分游离酶与底物的接触。
综上所述,分形理论作为一种研究酶解反应动力学的有效工具,已被学者广泛研究,并在酶水解机理研究方面取得了一定进展,这些研究工作为纤维乙醇高效转化技术的开发奠定了理论基础。酶分形动力学模型建立在传统米氏方程基础之上,其通过反应过程条件最终确定速率常数k和分形维数h的关系式,实现对复杂非线性反应过程的描述。由上述文献分析可知,酶分形动力学研究的关键问题是认识酶催化反应分形动力学与传统米氏动力学之间的区别,并针对其分形特性进行模拟,这也是酶促反应动力学研究的趋势。随着分形理论的不断发展,酶分形动力学的研究也将不断完善。
4 结语与展望
酶水解作为发酵法生产燃料乙醇的关键步骤之一,受到研究者的广泛关注。分形理论作为酶催化反应研究的有效方法之一,近年来不断被应用于木质纤维素酶水解过程。随着分形理论的不断发展与完善,须建立更简单、准确的酶水解动力学模型,进而阐明酶水解反应历程,为提高木质纤维素酶水解复杂的多相异质反应过程提供更好的改善路径。明确酶分形动力学与传统米氏动力学的区别,并针对酶分形动力学特性建立模型,是酶促反应动力学研究的关键问题。